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如何用elisa法测定人乙酰肝素酶含量?

点击次数:305 发布时间:2017/7/24
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中文说明书                                                UNIONHONEST

本品仅供研究使用                酶联免疫吸附测试  Enzyme linked lmmunosorbent Assay

                     乙酰肝素酶(HPA)ELISA检测试剂盒

 

用    途 用于人血清、血浆及相关液体样本中乙酰肝素酶(HPA)的测定。

检测原理

本试剂盒采用的生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法ELISA)测定样品中人乙酰肝素酶(HPA)的水平。向预先包被了人乙酰肝素酶(HPA)克隆抗体的酶标孔中加入乙酰肝素酶(HPA),温育;温育后,加入生物素标记的抗乙酰肝素酶(HPA) 抗体,再与链霉亲和素-HRP结合,形成免疫复合物再经过温育和洗涤,去除未结合的酶,然后加入底物A、B,产生蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅与样品中乙酰肝素酶(HPA)的浓度呈正相关

试剂盒组成 

 

        名  称

96孔配置

12孔×8

48孔配置

12孔×4条

  

 1

标准品(300U/ml)

0.5ml

0.5ml

稀释即用型

 2  

酶标包被板

1块

1块

已包被即用型

 3

标准品稀释液

3ml

3ml

即用型

 4

链霉亲和素-HRP

6ml

3ml

即用型

 5

30x倍浓缩洗涤液

20ml

20ml

蒸馏水稀释

 6

生物素标记的抗-乙酰肝素酶(HPA) 抗

2ml

2ml

即用型

 7

显色剂A液

6ml

3ml

即用型

 8

显色剂B液

6ml

3ml

即用型

 9

终止液

6ml

3ml

即用型

10

说明书

1份

1份

即用型

11

封板膜

2张

2张

不可反复使用

12

密封袋

1个

1个

即用型

需要而未提供的试剂和器材

  • 酶标仪(450nm检测波长滤光片,570nm或630nm校正波长滤光片) 。
  • 洗板机(可调注液量,保证每孔洗液加至0.35ml而不溢出)。
  • 超净工作台,生物安全柜,通风柜。
  • 高精度单道加液器(量程为0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl).
  • 高精度多道加液器(8道或12道,量程为50-300μl).
  • 37℃恒温箱。
  • 低温离心机。
  • 电冰箱(4℃,-20℃,-86℃).

9.  漩涡混合仪,低频振荡器等

注意事项

  • 从2-8℃取出的试剂盒,在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
  • 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准。
  • 免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和封板膜
  • 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
  • 底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。

6.   所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按生物废弃物处理。终止液为2M硫酸,使用时必须注意安全。

7.  各步骤加样均应使用加样器,并经常校准其准确性,以避免试验误差。一次加样时间zui好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

8.  每次试验测定的同时做标准曲线,。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔zui高浓度的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请zui后乘以总稀释倍数(×n)。

9.  配制试剂时,要用旋涡混合仪混匀。加入孔内的试剂,充分混匀对测试结果尤为重要,zui好使用微量振荡器(使用zui低频率),如无微量振荡器,可在反应前手工轻轻晃动酶标板1分钟,例如做圆周动作,使加入孔中的反应液混匀。

10.  实验用酶标仪应严格按使用说明书规范操作,并在使用前充分预热。

11.  手工洗板应注意:甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

 

样本要求

1.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

2.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存或根据存放,时间做相应温度调整,但避免反复冻融,(由于样本种类过多,每个单位处理方式不一样,本说明书不做详细介绍)。

 

操作程序

  • 标准品的稀释:(本试剂系统提供原倍标准品一支,用户请按照说明自行在小试管中倍比稀释)按下表格执行:

 150U/ml

(5号标准品)

120μl的原倍标准品加入120μl的标准品稀释液

 75U/ml

(4号标准品)

120μl的5号标准品加入120μl的标准品稀释液

   37.5U/ml

(3号标准品)

120μl的4号标准品加入120μl的标准品稀释液

  18.75U/ml

(2号标准品)

120μl的3号标准品加入120μl的标准品稀释液

  9.375U/ml

(1号标准品)

120μl的2号标准品加入120μl的标准品稀释液

  • 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。
  • 加样:1)空白孔:(空白对照孔不加样品,生物素标记的抗乙酰肝素酶(HPA)抗体,链霉亲和素-HRP其余各步操作相同 ;2)标准品孔:加入标准品50μl,链霉亲和素-HRP50μl标准品中已事先整合好生物素标记抗体,故在操作时不加,只加链霉素-HRP);3)样本反应孔:加入样本40μl,然后各加入抗- 乙酰肝素酶(HPA)抗体10μl链霉亲和素-HRP(空白孔除外)50μl。盖上封板膜,轻轻振荡混匀,37℃温育60分钟。
  • 配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释备用。
  • 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
  • 显色:每孔先加入显色剂A 50μl,再加入显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。
  • 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)
  • 测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值) 测定应在加终止液后10分钟以内进行。

 

结果判断

1.  每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。(若不减零孔值,标准曲线的零孔应相交于Y轴) 

2. 根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样品的OD值在回归方程计算出对应的样品浓度。也可以使用各种熟悉应用软件来计算。

3手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。推荐使用专业制作曲线软件进行分析计算结果

4.若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数

 

操作总结

 

准备试剂,样品和标准品

         

 

加入准备好的样品和标准品,生物素标记二抗和酶标试剂,37℃反应60分钟

 

 

洗板5次,加入显色液A、B,37℃显色10分钟

 

 

   加入TMB终止液

 

 

10分钟内酶标仪测OD值

 

 

  计算待测样本因子含量

试剂盒性能

  1.  准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9200。
  2.  灵敏度:zui小可检测浓度达,2.03U/ml
  3.  特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
  4.  重复性:板内、板间变异系数均小于15%。

5 . 回收率:70-110%.

6. 贮藏:2-8℃,避光防潮保存。

7. 有效期:6个月

8. 检测范围:260U/ml -8.12U/ml

 

 

 

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