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人胆碱酯酶ELISA试剂盒的试验步骤

点击次数:378 发布时间:2017/3/10
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中文说明书

_____________________________________________________                                      

 

              人胆碱酯酶(cholinesterase)ELISA检测试剂盒

 

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人胆碱酯酶(cholinesterase)捕获抗原的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胆碱酯酶(cholinesterase)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法

1.  血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.  血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.  细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.  组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.  保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

  • 酶标仪(450nm
  • 高精度加样器及枪头:0.5-10uL2-20uL20-200uL200-1000uL
  • 37℃恒温箱

操作注意事项

  1.   试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
  2.   实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
  3.   预处理后的样本无需稀释,直接取10μL加样即可。
  4.   严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
  5.   所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

名称

96孔配置

48孔配置

备注

微孔酶标板

12×8

12×4

标准品(500 ng/ml

0.5mL

0.5mL

按说明书进行稀释

标准品稀释液

6mL

3mL

按说明书进行稀释

样本稀释液

6mL

3mL

按说明书进行稀释

检测抗体-HRP

6mL

3mL

20×洗涤缓冲液

20mL

20mL

按说明书进行稀释

底物A

6mL

3mL

底物B

6mL

3mL

终止液

6mL

3mL

封板膜

2

2

说明书

1

1

自封袋

1

1

注:标准品用标准品稀释液依次稀释为:50025012562.531.20ng/ml.

试剂的准备

 20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按120稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

  1.   手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。
  2.   自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

操作步骤

  1.   从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
  2.   设置标准品孔、样本孔和空白孔,空白孔什么都不加;标准品孔各加不同浓度的标准品50μL
  3.   待测样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL
  4.   随后标准品孔和样本孔中(空白孔不加)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体50μL,,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min
  5.   弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
  6.   所有孔加入底物AB50μL37℃避光孵育15min
  7.   所有孔加入终止液50μL15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

 绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。

 

试剂盒性能

  •  准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900
  •  灵敏度:zui低检测浓度小于1.0 ng/ml
  •  特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
  •  重复性:板内、板间变异系数均小于15%
  •  贮藏:2-8℃,避光防潮保存。
  •  有效期:6个月
  •  检测范围:15.6 ng/ml -500ng/ml

免责声明

  •   试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或体实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。
  •   严格按照说明书操作,不同批号不可交换使用,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。

 

 

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