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ELISA试剂盒氨基转移反响的定性判定

点击次数:651 发布时间:2017-09-20

一、ELISA试剂盒试验目的

(1)学习一种判定氨基转移作用的简练方法及其原理;

(2)进一步掌握纸层析的原理和操作技能;

(3)了解氨基转移作用在中心代谢中的意义。

二、试验原理  

氨基移换酶也称转氨酶,它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的α-酮基交换,这种作用称为氨基移换作用。它在生物体内蛋白质的合成与分解等中心代谢中,在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的互相联络、互相转化上,都起着很重要的作用。任何一种氨基酸进行转氨作用时,都由其专心的转氨酶催化。它们的zui适pH靠近7.4。在各种转氨酶中,以谷氨酸—草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶、GOT)及谷氨酸—丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶、GPT)生机zui强。

三、ELISA试剂盒试剂与器材 

解剖用具、离心机、恒温水浴、干燥箱、台秤、层析系统等。

1/15mol/L磷酸缓冲液(pH=7.4)、1%谷氨酸溶液(用KOH中和至中性)、1%丙酮酸溶液(用KOH中和至中性)、0.1%碳酸氢钾溶液、0.05%碘乙酸溶液、15%三氯醋酸溶液、标准丙氨酸溶液(0.1%)、标准谷氨酸溶液(0.1%)、0.1%水合茚三酮乙醇溶液、酚溶剂。

四、ELISA试剂盒操作方法 

将兔击晕,迅速解剖,取出肝脏,在低温条件下剪碎。称取匀浆后,离心取上清液,即为制备的酶液。体外氨基移换反应。纸上层析法检查每人4个点(标准丙氨酸溶液、标准谷氨酸溶液、对照上清液、样品上清液)。点样放入层析罩内。用被酚所饱满的水溶液,平衡后,用带小漏斗的玻璃管从层析罩上加饱合酚试剂25ml于层析缸内。然后,当即盖紧塞子,当溶剂前沿到达距滤纸上端约2.5cm处,取出滤纸,晾干或吹干,以除去酚溶剂,喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液,放入烘箱中显色氨基酸与茚三酮反应,在滤纸上呈现紫红色斑斓。

五、关键步骤与注意事项

① 取动物新鲜组织制备酶液,防止酶失活。

② 加碘乙酸克制酶解作用。

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